一款和微流控芯片匹配的打印装置及打印方法与流程

1.本发明涉及微粒打印领域，特别是一款和微流控芯片匹配的打印装置及打印方法。


背景技术：

2.单细胞分析可以获得通常在传统的基于人群研究中被忽视的数据，已成为再生医学、临床诊断和细胞治疗的强大工具，而将单细胞打印接种到单独的培养室是单细胞分析的关键要求之一。
3.成功地从细胞群中分离出单个细胞，随后维持细胞活力以极低的体积转移到指定的容器是后续细胞和分子分析的第一步和关键一步，包括单细胞克隆、pcr、蛋白质表达、基因测序。高效的单细胞打印方法成为单细胞打印系统的关键技术。目前，国内外能够进行单细胞分选的研究非常多，但在绝大多数的研究中单细胞分离后都依旧停留在原微流控芯片内，或者只能在微流控芯片的下游做一些有限的单细胞分析，并不能将单个细胞无侵害的确定性接种到其他容器中，限制了单细胞分析的发展。因此，单个细胞打印提取技术显得至关重要。
4.现有先进的单细胞打印有基于压电、加压打印、接管引流或接触等方式。这些方法虽然充分的利用了微流控技术的优势，但是要么对设备的要求高过程繁琐，要么手工操作打印效率低，并且制造过程较为复杂。
5.德国弗莱堡大学peterkoltay等介绍了一种用全自动原型仪器以压电陶瓷驱动的非接触喷墨打印单个活细胞的装置。该技术基于透明微流控芯片和相机辅助自动检测系统。芯片内部的细胞被限制在微滴中，通过电信号控制压电陶瓷挤压储存细胞的液体腔使液滴滴落将单细胞打印出来。日本名古屋大学feng, lin等人设计的单细胞打印芯片出口处放置分配喷嘴。最后，筛选出来的卵母细胞停在分配喷嘴孔处被上方的气流喷射到培养阵列中实现单细胞的打印。哈尔滨工业大学陈华英等使用了一种最简单的打印方法，该芯片通过气动微阀筛选了单个细胞后，在芯片上方通过针头插上的管道直接将细胞引流接种到微孔板中。上海交通大学的陈翔等在芯片下方打孔，插入毛细玻璃管，将包含细胞或者微粒的液滴打印至收集基板上。美国安德森癌症中心的lidong qin等介绍了可用于单细胞分离的hand-held single-cell pipettes(hscp)。这类hscp包括一个双通道吸管和一个hscp尖端。hscp尖端的芯片中设计有单细胞捕获的钩子，而连在尖端的双通道吸管可以通过正压和负压的操作经过准备、捕获、冲洗、释放四个步骤将单细胞分离出来。相似的，lidong qin的团队也设计出了由 scp-tip,air-displacement pipette(adp)和adp-tips三个模块组成的单细胞移液管用于单细胞转录组测序。还有一些研究人员通过形成的微小液滴与下方的微孔触碰实现液滴的被动滴落来达到打印的目的。
6.上述方法极大地推动了单细胞打印的发展，但设计出新的打印技术实现先进的单细胞生化分析仍然是必要的，因此，本发明在前人的基础上新颖的提出了一种操作简便，能够进行单细胞/微粒高效打印的微流控打印出口。
7.综上所述，与本发明相比，背景技术具有明显的不足。简要概括如下：
8.peter koltay等的这种压电式的单细胞打印对设备的要求高，制造复杂，价格昂贵，并且需要其他精密设备提供电信号。feng,lin等的这种方法和lidongqin等的这类移液管式的单细胞打印通过加压打印无法确保缓和的流体剪切力，对细胞伤害性较大，最重要的是加压会很大程度的影响到芯片内部流道的流体动力学压强分布，造成芯片内部流体回流现象，不适合高通量的细胞打印。陈华英等的这种向上打孔引流的方法很容易使细胞由于重力作用沉淀在出口处。而陈翔等的这类向下打孔引流的方法虽然避免了细胞沉淀，但操作更复杂了，并且细胞极易卡在毛细玻璃管和芯片出口的缝隙处，很难实现单细胞的确定性打印。
9.上述方法及不足之处简要概括如下：
10.表1各种背景技术的不足
[0011][0012]
本发明目的是开发一款辅助单细胞打印系统实现打印接种的打印出口。通过图像识别细胞和微粒动态调节辅助打印通道的流速控制液滴形成，实现高效连续的单个或多个细胞或微粒的打印。该出口包含主要工作通道外增加了一条或者多条平行于主打印通道的可以随意控制流速大小的辅助打印通道。当打印通道打印出单细胞或者微粒形成微液滴还未滴落时，辅助打印通道就会流出液体形成能迅速滴落的大液滴与打印出口的微液滴融合滴落。因为辅助打印通道的液体流动及液滴的大小对打印通道内液体流动无影响，因此可以通过加大辅助打印通道的流速加快形成滴落液滴，极大地提高了打印细胞或微粒的效率。该方法不需要额外设备，成本低且制造简单，控制方法灵活。此外，该方法还可以图像识别控制液滴形成的时间间隔，实现一个滴落液滴里包含期望个数的细胞或者微粒。最终可实现单个或者多个细胞/颗粒的高精度打印。
[0013]
发明目的包括：
[0014]
1)利用辅助打印通道加大流速快速形成滴落的液滴，实现单个或者多个细胞或微粒的快速打印；
[0015]
2)打印出口一次成型无需二次加工，达到无其他因素堵塞通道打印出的细胞或微球的目的，并且辅助打印通道并未和打印出口直接相连，对芯片内的流体水动力特性无影响；
[0016]
3)根据图像、电信号、光信号等识别颗粒个数和流速，进而利用辅助打印通道液体流动控制液滴大小和滴落时间，实现单细胞/微粒、双细胞/微粒、三细胞/微粒等数量细胞/微粒液滴的打印。
[0017]
4)根据控制流速不同，实现包裹不同内容物液体液滴的快速打印。


技术实现要素：

[0018]
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一款和微流控芯片匹配的打印装置及打印方法；通过图像识别细胞和微粒动态调节辅助打印通道的流速控制液滴形成，实现高效连续的单个或多个细胞或微粒的打印，也可以实现油包水或者水包油液滴的打印。
[0019]
具体的技术方案如下：
[0020]
一款和微流控芯片匹配的打印装置，包括单侧辅助打印通道、双侧辅助打印通道和四面环绕式辅助通道，均用于帮助微粒快速打印。
[0021]
优选地，单侧辅助打印通道包括：微粒样品入口；微粒样品入口的底部设置打印通道，打印通道的一侧设置辅助打印通道，辅助打印通道的顶部设置辅助供液入口。
[0022]
优选地，双侧辅助打印通道包括微粒样品入口，微粒样品入口的底部设置打印通道，打印通道的两侧分别设置辅助打印通道，辅助打印通道的底端设置辅助供液入口，打印出口设置于打印通道的底端，打印出口的尖端的大小用于决定最终滴落液滴的大小。
[0023]
优选地，四面环绕式辅助通道包括辅助供液出口、辅助打印通道和辅助打印通道环形液；辅助打印通道的顶部设置辅助供液出口，辅助供液出口底部设置辅助打印通道环形液。
[0024]
优选地，本发明还可以通过控制流速形成水包油或者油包水的液滴。
[0025]
优选地，和微流控芯片匹配的打印装置的打印方法，包括以下步骤：
[0026]
步骤一：系统工作前，需要将打印系统竖直放置；
[0027]
步骤二：打印通道处于打开状态，关闭辅助打印通道，利用图像识别系统确定有单个或多个粒子随液体流出至打印口外部形成微小液滴；
[0028]
步骤三：打开辅助打印通道，根据所需液滴大小将定量的辅助打印液体在特定时间注射到出口，使之与步骤二的微小液滴融合形成大液滴并立即滴落；
[0029]
步骤四：关闭辅助打印通道；
[0030]
步骤五：重复以上步骤2至步骤4实现循环打印。
[0031]
优选地，步骤二的打印通道内可以是无任何粒子的液体水，此时辅助通道是油就可以用这个方法产生油包水的液滴，液滴中水和油的量都可调；
[0032]
反之，打印通道是油，辅助通道是水，产生水包油的液滴，液滴的大小与打印出口的尖端大小有关，芯片尖端做的越小可滴落的液滴越小；
[0033]
打印通道内是有粒子或细胞的液体时，辅助通道是油，此时打印出油包水，其中水里有单个或多个粒子或细胞；
[0034]
打印通道内是有粒子或细胞的液体时，辅助通道可以是跟打印通道内液体一样水或细胞培养基，此时打印出来就是大液滴，直接滴落。
[0035]
优选地，通过微流控芯片匹配的打印原理，将此发明原理运用于芯片中，包括以下形式：一次性成型制造、打印头和芯片组合键合以及环绕式出液打印。
[0036]
本发明一款和微流控芯片匹配的打印装置及打印方法的有益效果如下：
[0037]
1.操作简便，实现自动化，高效快速
[0038]
只需控制辅助打印出口的流速产生足够大的液滴与打印出口的液滴融合滴落即可，无需其他多余的操作。打印时间不再取决于打印出口的流速，实现快速高效打印。
[0039]
2.设计和加工简单，降低成本
[0040]
新增的辅助打印出口可跟随芯片打印出口一起制造，微流控芯片可一次曝光形成通道，额外成本基本忽略不计，并且一次成型的出口不会产生缝隙卡住微粒。
[0041]
3.对内部通道流场无侵害性打印
[0042]
辅助打印出口在打印出口之外，不影响细胞流道内的流速，无需为了提高打印效率而采用较大打印流速，对打印通道内的流体力学特性影响微小，从而不会影响细胞活性，适用于多种单细胞打印系统。
[0043]
4.可实现任意数量细胞或颗粒的包裹。
[0044]
根据光信号图像识别颗粒个数，再通过电信号控制辅助打印通道的流速进而控制液滴大小和滴落时间实现多个微粒液滴的打印。
[0045]
5.可实现包裹不同内容物的液滴打印
[0046]
根据流速快慢形成不同的包裹液滴，实现打印油包水或者水包油的液滴。
附图说明
[0047]
图1为本发明方法结构示意图；a)单侧辅助打印通道示意图；b)双侧辅助打印通道示意图。
[0048]
图2打印结构打印单微粒原理示意图；a)分选出来的单个微粒在打印通道出口形成微液滴，b)打开辅助打印通道，迅速在出口形成大液滴，c)辅助打印通道的液体继续大流速输出使出口的液滴慢慢扩大并与打印通道出口处包含单个微粒的微液滴融合成一个液滴，d)辅助打印通道继续通液体使下方液滴达到足够的大小，液滴滴落完成一轮单微粒的打印。
[0049]
图3打印结构打印单微粒流程示意图；a)图像识别动态控制辅助打印示意图。微粒快到达打印通道出口被照相机的图像识别得到一个高频脉冲之后，程序控制加大辅助打印通道的流速，加快出口端大液滴的形成；b)液滴融合图。辅助打印通道的液体继续大流速输出使出口的液滴慢慢扩大并与打印通道出口处包含单个微粒的微液滴融合成一个液滴；c)液滴滴落图。辅助打印通道继续通液体使下方液滴达到足够的大小，液滴滴落完成一轮单微粒的打印。
[0050]
图4打印结构打印多微粒流程示意图双微粒打印为例；a)图像识别动态控制辅助打印示意图；微粒快到达打印通道出口被照相机的图像识别得到两个高频脉冲之后，程序控制开始加大辅助打印通道的流速，加快出口端大液滴的形成；b)液滴融合图；辅助打印通道的液体继续大流速输出使出口的液滴慢慢扩大并与打印通道出口处包含两个微粒的微液滴融合成一个液滴；c)液滴滴落图；辅助打印通道继续通液体使下方液滴达到足够的大小，液滴滴落完成一轮双微粒的打印。
[0051]
图5本发明设计的打印通道、辅助打印通道和上游分选的微流控芯片光刻在一起示意图，包含一个打印通道和一个辅助打印通道。
[0052]
图6打印头和上游微流控芯片键合示意图，打印头上包括一个辅助打印通道和一个打印通道，微流控芯片上包括一个辅助打印供液通道和一个微粒通道。 a)打印头和微流控芯片连接图，将细胞通道与打印头上的细胞入口对准，辅助打印供液通道与打印头上的辅助打印通道对准；b)打印头和微流控芯片键合图。
[0053]
图7辅助打印通道芯片和上游微流控芯片键合示意图，打印头上包含一个辅助打
印通道，微流控芯片上包含一个打印通道；a)辅助打印通道芯片和微流控芯片连接图；b)辅助打印通道芯片和微流控芯片对准键合图。
[0054]
图8环形围绕式辅助打印通道芯片和上游微流控芯片键合示意图，打印头包含辅助供液入口和辅助打印通道和一个辅助打印通道环形出液口，微流控芯片包含一个微粒通道；a)环形围绕式辅助打印通道芯片图；b)辅助打印通道芯片和微流控芯片连接图；c)辅助打印通道芯片和微流控芯片对准键合图。
[0055]
图9水包油和油包水液滴打印原理图，被包裹的液体流出慢，包裹液体流出快，迅速形成包裹液滴滴落；a)油包水液滴打印原理图；b)水包油液滴打印原理图。
具体实施方式
[0056]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0057]
本发明主要为可以和微流控芯片匹配的一款和微流控芯片匹配的打印装置，帮助微粒快速打印，打印设计如图1所示，图1a为单侧的辅助打印通道设计，包含一个微粒样品入口、一个辅助供液入口、一个辅助打印通道以及一个打印通道，图1b为双侧的辅助打印通道设计，包含一个微粒样品入口、一个辅助供液入口、两个辅助打印通道以及一个打印通道。在打印微粒时根据图2，
[0058]
按如下步骤实施：
[0059]
步骤一：系统工作前，需要将打印系统竖直放置；
[0060]
步骤二：打印通道处于打开状态，关闭辅助打印通道，利用图像识别系统确定有单个或多个粒子随液体流出至打印口外部形成微小液滴；
[0061]
步骤三：打开辅助打印通道，根据所需液滴大小将定量的辅助打印液体在特定时间注射到出口，使之与步骤二的微小液滴融合形成大液滴并立即滴落；
[0062]
步骤四：关闭辅助打印通道；
[0063]
步骤五：重复以上步骤2至步骤4实现循环打印。
[0064]
更深地，本快速打印方法还可以和图像识别系统结合在一起，实现自动化的打印，节省操作步骤。
[0065]
打印通道内可以是无任何粒子的液体例如水，此时辅助通道是油就可以用这个方法产生油包水的液滴，水和油的量都可调。反之，可以产生水包油的液滴。
[0066]
打印通道内是有粒子或细胞的液体时，辅助通道可以是油，此时打印出油包水，其中水里有单个或多个粒子或细胞。
[0067]
打印通道内是有粒子或细胞的液体时，辅助通道可以是跟打印通道内液体一样例如水或细胞培养基，此时打印出来就是大液滴，直接滴落。
[0068]
辅助通道的作用就是：(1)提供与打印通道一不同的液体，形成油包水或者水包油，且通过形成较大液滴，使之迅速滴落(2)提供与打印通道相同的液体，主要是增加液体体积，使之迅速滴落。
[0069]
如图3所示，在打印微粒时按如下步骤实施：
[0070]
步骤一：系统工作前，需要将打印系统竖直放置；
[0071]
步骤二：打印通道处于打开状态，关闭辅助打印通道，利用图像识别系统确定有单个或多个粒子随液体流出至打印口外部形成微小液滴；
[0072]
步骤三：打开辅助打印通道，根据所需液滴大小将定量的辅助打印液体在特定时间注射到出口，使之与步骤二的微小液滴融合形成大液滴并立即滴落；
[0073]
步骤四：关闭辅助打印通道；
[0074]
步骤五：重复以上步骤2至步骤4实现循环打印。
[0075]
特别的也可以实现多微粒的打印，如图4打印双微粒为例。由于都是自动化的打印，实施步骤和上述的单个微粒打印步骤一样，只不过将图像识别系统设置为两个高压脉冲后开启注射泵开关。
[0076]
以上是本发明的工作原理，而将本方法运用到大众的微流控芯片中也有多种形式。本打印方法是微粒分选系统下游的一个结构设计，上游分选系统将微粒分选完成之后通过本打印结构快速打印出来，将本发明的方法应用到上游微流控系统中可分为四种形式：一种为直接将本发明设计的打印通道、辅助打印通道和上游分选的微流控芯片光刻在一起，如图5所示，包含一个打印通道和一个辅助打印通道；另一种可以将本打印方法的打印通道、辅助打印通道制造在单独的打印头上，然后将打印头和上游的微流控芯片键合在一起，辅助打印通道入口连接微流控芯片的辅助打印供液通道，打印通道入口连接上游微流控微粒筛选芯片的微粒通道，
[0077]
如图6所示，打印头上包括一个辅助打印通道和一个打印通道，微流控芯片上包括一个辅助打印供液通道和一个微粒通道；还有一种当原本上游的微流控芯片中就有一个打印出口时，将本打印方法的辅助打印通道制造在单独的芯片上，将芯片和上游的微流控芯片键合，
[0078]
如图7所示，打印头上包含一个辅助打印通道，微流控芯片上包含一个打印通道。最后一种辅助打印通道流出来的液体呈环形流出，环形通道将微粒打印通道环形围住，使辅助打印通道的液体更好的包裹打印通道流出的微粒样品，
[0079]
如图8所示，打印头包含辅助供液入口和辅助打印通道和一个辅助打印通道环形出液口，微流控芯片包含一个微粒通道。
[0080]
更深层次地，还可以将本发明运用于液滴微流控，通过控制流速形成水包油或者油包水的液滴。如图9所示，打印通道通入水，辅助打印通道通入油，形成油包水液滴的步骤如下：
[0081]
步骤1：系统工作前，需要将打印系统竖直放置。
[0082]
步骤2：保持辅助打印通道关闭，打开打印通道，使一定量的打印液体(水) 流出打印口，形成小水滴；
[0083]
步骤3：关闭打印通道，并打开辅助打印通道，使一定量的辅助液体(油) 流出，并与打印口的小水滴融合形成大液滴，并迅速滴落。
[0084]
步骤4：关闭辅助打印通道；
[0085]
步骤5：重复以上步骤2、3、4循环打印油包水的液滴。
[0086]
而打印水包油的液滴时同样按以上的步骤，只不过将油从打印通道通入，水从辅助打印通道通入。
[0087]
通过微流控芯片匹配的打印原理，将此发明原理运用于芯片中，包括以下形式：一次性成型制造、打印头和芯片组合键合以及环绕式出液打印。
[0088]
一次性成型制造是指和上游芯片在一个装置上一体成型。
[0089]
打印头和芯片组合键合是指打印头单独制作然后和芯片组装起来。
[0090]
环绕式出液打印是指辅助打印通道在三维方向包裹打印通道。